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甘肃省手足口病防控技术方案（试行）

【颁发部门】 甘肃省卫生厅

【发文字号】 甘卫疾控发[2008]136号

【颁发时间】 1970-08-21

【实施时间】 1970-08-21

【效力属性】 有效

手足口病（hand-foot-mouth disease， hfmd）是由多种肠道病毒引起的常见传染病，以婴幼儿发病为主。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患儿可出现中枢神经、呼吸系统损害，引发脑炎、急性弛缓性麻痹、脑水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，易发生死亡。少年儿童和成人感染后多不发病，但能够传播病毒。引起手足口病的肠道病毒包括肠道病毒71型（ev71）和a组柯萨奇病毒（coxa）、埃可病毒（echo）的某些血清型。ev71感染引起重症病例的比例较大。肠道病毒传染性强，隐性感染比例大，传播途径复杂，传播速度快，易引起暴发或流行。为指导各地做好手足口病的预防控制，依据卫生部《手足口病预防控制指南（2008版5月13日更新）》、《肠道病毒（ev71）感染诊疗指南（2008年版）》、《医疗机构手足口病诊疗技术指南（试行）》制定本方案。 一、目的 （一）指导医疗机构、疾病预防控制机构开展手足口病的疫情报告和监测；全面落实综合性防治措施，科学有效控制疫情； （二）加强手足口病病例的救治工作，减少危重病例死亡，提高治愈率； （三）指导疾病预防控制机构开展流行病学调查和实验室检测； （四）指导疾病预防控制机构、医疗机构开展公众预防和疫情应急处置。 二、病原学 引起手足口病的病原体主要为小rna病毒科、肠道病毒属的柯萨奇病毒（coxsackie virus） a组16、4、5、7、9、10 型， b组2、5型；埃可病毒（echo viruses）和肠道病毒71型（ev 71）。其中以ev 71及cox al6型最为常见。 肠道病毒适合在湿、热的环境下生存与传播，对乙醚、去氯胆酸盐等不敏感，75%酒精和5%来苏亦不能将其灭活，但对紫外线及干燥敏感。各种氧化剂（高锰酸钾、漂白粉等）、甲醛、碘酒都能灭活病毒。病毒在50 ℃可被迅速灭活，但1mol浓度二价阳离子环境可提高病毒对热灭活的抵抗力，病毒在4 ℃可存活1年，在- 20 ℃可长期保存，在外环境中病毒可长期存活。 三、流行病学 （一） 流行概况 手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。1957年新西兰首次报道该病。1958年分离出柯萨奇病毒，1959年提出“手足口病”命名。之后保加利亚、英国、马来西亚等国均有本病流行。 我国于1981年上海首次报道本病，此后，北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、青海和广东等10几个省份均有本病报道。1983年天津发生柯萨奇病毒a16型引起的手足口病暴发，5-10月间发生了7000余病例。1998年，我国台湾地区发生肠道病毒71型感染引起的手足口病和疱疹性咽峡炎流行，监测哨点共报告129106例病例。当年共发生重症病人405例，死亡78例，大多为5岁以下的幼儿。 手足口病流行无明显的地区性。一年四季均可发病，以夏秋季多见，冬季的发病较为少见。该病流行期间，可发生幼儿园和托儿所集体感染和家庭聚集发病现象。 （二）　传染源和传播途径 人是人肠道病毒唯一宿主，患者和隐性感染者均为本病的传染源。肠道病毒主要经粪-口和/或呼吸道飞沫传播，亦可经接触病人皮肤、粘膜泡疹液而感染。是否可经水或食物传播尚不明确。病人粪便、疱疹液和呼吸道分泌物及其污染的手、毛巾、手绢、牙杯、玩具、食具、奶具、床上用品、内衣以及医疗器具等均可传播本病。 该病潜伏期一般为3～7天，没有明显的前驱症状，多数病人突然起病。发病前数天，感染者咽部与粪便就可检出病毒，通常以发病后一周内传染性最强。 （三）易感性 人对肠道病毒普遍易感，显性感染和隐性感染后均可获得特异性免疫力，持续时间尚不明确。病毒的各型间无交叉免疫。各年龄组均可感染发病，但以≤3岁年龄组发病率最高。 四、诊断与治疗 各级各类医疗机构要严格诊断标准，注意鉴别诊断，科学合理诊断手足口病（参见《手足口病预防控制指南（2008版5月13日更新）》、《肠道病毒（ev71）感染诊疗指南（2008年版）》、《医疗机构手足口病诊疗技术指南（试行）》），努力做到早发现、早诊断、早治疗。认真落实转诊制度、病例筛选制度和分类救治原则，及早发现和及时救治危重患者，防止出现死亡病例。对住院手足口病人要提高诊治效率，使患者尽快康复。 五、疫情报告和管理 （一）疫情报告 1.自2008年5月2日起，手足口病纳入丙类传染病管理。 各级各类医疗机构要按照《中华人民共和国法定传染病防治法》和《传染病信息报告管理规范》的有关规定，对符合上述病例定义的手足口病病例进行报告。 2．报告内容与方法 发现手足口病患者时，要在《中华人民共和国法定传染病报告卡》中“其他法定管理及重点监测传染病”一栏中填报该病。实行网络直报的医疗机构应于24小时内进行网络直报。未实行网络直报的医疗机构应于24小时之内寄送出传染病报告卡。报告病例分“临床诊断病例”和“实验室诊断病例”两类。如为实验室诊断病例，则应在报告卡片“实验室检测结果”栏内选择相应肠道病毒的具体型别，在“重症患者”一栏选择“是、否”为重症患者。报告卡基本项目要填全。报告卡中带“*”部分为必填项目。必须填写患者工作单位，如为托幼儿童或学生应填写托幼机构或学校名称。现住址必须完整，农村填写到行政村下的自然村，有门牌号的应记录，城镇居民填写到门牌号。基本格式为“某某省，某某市，某某县（区），某某乡镇（街道），某某行政村（居委会）某某自然村”。 为便于联系，诊疗医师尽可能记录填写就诊者联系电话。 根据报告卡进行网络直报时，应录入完整信息。发现卡上信息不全要追踪补齐。 传染病报告卡由首诊医师填写。 对于回顾调查发现的病例以及漏报后的补报病例要在备注栏标示。 （二）疫情管理 县（区）级疾病预防控制机构疫情管理人员，要保证每日（包括节假日）上网浏览6次以上，及时对疫情报告信息进行审核、查重等订正工作，查重条件可按姓名、性别、现住址、病种及其它项目认真审核，注意查询外地报当地卡，严禁延时后集中审卡，所有卡片必须保证当日审核。对每一张电子卡片都要打开后详细逐项审核，发现有疑问、信息不全要追踪核查，保证网络直报数据的质量。同时加强对辖区医疗机构网络直报技术指导，特别是重点做好对当地手足口病定点医疗机构的指导和信息沟通。及时对网络直报的个案信息进行专题分析，使之成为各地政府清楚掌握疫情的主渠道。日报常规按照“审核日期”统计到前一天24时止。如果需要专门分析，可导出个案用电子表格按需求进行分析。 应加强主动搜索，发现异常升高或病例呈聚集性分布或暴发疫情或出现重症病例或死亡病例，应在2小时内进行核实，确定真实性后，立即向同级卫生行政部门及上级疾病预防控制机构电话报告，随后2小时内完成书面报告，以传真形式逐级上报，并根据疫情发展、处置情况，及时上报进程报告和结案报告。 （三）局部地区或在同一托幼机构、学校等集体单位发生手足口病流行或暴发时，按照《突发公共卫生事件应急条例》、《全国突发公共卫生事件应急预案》、《突发公共卫生事件与传染病疫情监测信息报告管理办法》、《甘肃省突发公共卫生事件应急预案》及有关规定，及时进行突发公共卫生事件信息报告。 暴发疫情：是指1周内，同一学校、托幼机构等集体单位、自然村寨（居委会）发生5例及以上病例；或1例及以上重症病例，或发生1例及以上手足口病死亡病例。 六、现场处置 坚持属地化原则，上级疾病预防控制机构可以给予技术指导和实验室支持，根据疫情需要参与现场处置工作。 在现场处置工作中，坚持控制优先、实验室和流行病学调查相结合的原则，采取边抢救、边调查、边核实、边处理的方式，以有效措施控制事态发展。根据流行病学调查信息，将患者生活、学习或玩耍地点作为处置重点（见附件2）。 （一）流行病学调查 发现手足口病报告病例数明显增多、病例呈聚集性分布、重症病例或死亡病例时，应组织开展流行病学调查。 接到疫情报告后，属地疾病预防控制机构应在2小时内，对报告的病例进行核实诊断，确定流行或暴发的存在。一经查实，立即组织派遣应急处理人员赶赴现场或接诊医院，迅速开展流行病学调查。住院病例、暴发疫情个案调查率应达100％，就诊较集中的医疗机构的个案调查率应达50％以上。在病例个案调查时，要详细了解一般情况、流行病学接触史、发病就诊过程、临床表现、实验室检验结果、危险因素等情况；对临床表现和临床检验项目等内容的结果，要及时与有关医院联系，从病历中提取。个案调查要由流行病学专业人员承担，逐一问卷调查，表格填写要工整、仔细，不得有漏项、缺项 （个案表见附件5）。所有个案调查表和采样登记表等要有专人负责，对收集的信息及时进行分析。主要分析内容是病例的分布特点，时间、空间等聚集性病例分布特点，病例就诊医院变化情况，病例就诊间隔的变化情况，发病趋势分析等。 （二）规范采集标本 发现手足口病报告病例数明显增多、病例呈聚集性分布、重症病例或死亡病例时应采集咽试子、粪便、水疱液和双份血清标本，每个病例的标本要详细填写采送样登记表、个案表，各种标本的采样方法和有关要求说见附件3、4、5。采样登记表的编号要与个案调查表的编号一致。 （三）疫情控制 1.控制传染源 对患者实行隔离治疗，严格管理传染源。对住院治疗的患者，要限制其陪护和接触者人数，接触人员要做好个人卫生及个人防护；对居家治疗的病人，具体指导、落实隔离措施。患者的密切接触者可居家医学观察，一旦出现类似症状督促及时到定点医院治疗。 2.采取措施，切断传播途径 患者衣物用品、吐泄物、吐泻容器及污染场所等用含氯消毒剂、生石灰进行消毒，防止家庭及医院内交叉感染；疫点、疫区所在地要及时组织开展爱国卫生运动，积极灭蝇、灭蚊，对垃圾、粪便、污水及时清运和消毒处理，整治城乡卫生环境，严防水源污染。 3.在手足口病流行季节，疾病预防控制机构应督促、指导幼托机构和学校（尤其是出现病例的幼托机构和学校）加强教室、校舍通风，落实消毒制度，对儿童玩具用品进行每日消毒处理；落实每日晨检制度，及时了解儿童缺课情况，并做好记录，发现患有发热或疱疹的患儿，应立即动员家长送患儿及时到医院就诊，进行家庭隔离治疗或住院隔离治疗，直至病愈方可返校。 做好患病儿童的随访工作，随时掌据患儿的病情进展，病情加重应立即动员家长将患儿转往条件好的二级以上综合医院或儿童医院。 当同一幼托机构内出现暴发疫情或重症病例或死亡病例时，建议该幼托机构暂时停课2-3周；当学校出现暴发疫情或重症病例或死亡病例，根据疫情进展情况以及疫情控制需要，必要时可建议采取停课或部分停课措施，以保护易感儿童。 4.在手足口病流行季节及疫情发生时期，各级疾病预防控制机构应积极开展健康教育，采取张贴宣传画、发放宣传单、板报等形式，向社会人群宣传防治知识，提高群众防病知识水平。 暴发疫情处理结束后，要及时收集、整理、统计、分析调查资料，写出详细的报告，报告主要内容包括：事件名称、事件类别、发生时间、地点、涉及的地域范围、人数、主要症状与体征、病情轻重情况、可能的原因、已经采取的措施、随访情况、事件的发展趋势、下一步工作计划等。个案表、调查报告以传真形式逐级上报。 七、实验室检测 （一）在手足口病流行季节，省疾病预防控制中心组织开展对手足口病病例的实验室监测。本年度初次发病的县（区）应采集5-10例患者标本，送省疾病预防控制中心进行检测（见附件10）。如有住院或重症或死亡病例，应对所有病例进行标本采集及实验室检测。如有暴发疫情应采集部分标本进行病原检测。有检测能力的市（州）可以自行检测，阳性标本送至省疾病预防控制中心复核。 （二）检测结果的报告与反馈 省疾病预防控制中心每周五将已完成实验室检测的病例个案调查表以及检测结果一览表（见附件6）上传至中国疾病控预防控制中心。并及时以书面报告形式向各市（州）疾病预防控制机构反馈。 八、日报告制度 当出现暴发疫情或重症病例或死亡病例时，要求实行日报告（见附件7）。即接诊医院除对手足口病例进行网络直报外，应于次日9：00前向辖地内县（区）疾病预防控制机构报告前日0：00-24：00内的发病情况，县（区）级疾病预防控制机构应于11：00前向市（州）级疾病预防控制机构和本级卫生行政部门报告，市（州）疾病预防控制机构于13：00前以传真形式向本级卫生行政部门和省疾病预防控制中心上报，省疾病预防控制中心汇总分析后于15：00前以简报形式上报省卫生厅。 省疾病预防控制中心传真0931-8265950，电话：0931-8272156， 九、预防控制措施 手足口病传播途径多，婴幼儿和儿童普遍易感。做好个人、家庭和托幼机构的卫生，防止医院感染是预防手足口病的关键措施。 （一）个人预防措施 1.看护人要给孩子勤洗手，并教育指导儿童养成良好的洗手习惯。饭前便后、外出后要用肥皂或洗手液洗手； 2.看护人接触儿童前、替幼童更换尿布、处理粪便后均要洗手，并妥善处理污物； 3.婴幼儿使用的奶瓶、奶嘴、餐具及毛巾使用前后应充分清洗； 4.不要让儿童喝生水、吃生冷食物，避免接触患病儿童； 5.本病流行期间不宜带儿童到人群聚集、空气流通差的公共场所，注意保持家庭环境卫生，居室要经常通风，勤晒衣被； 6.儿童出现相关症状要及时到医疗机构就诊。居家治疗的儿童，不要接触其他儿童，父母要及时对患儿的衣物进行晾晒或消毒，对患儿粪便及时进行消毒处理；轻症患儿不必住院，宜居家治疗、休息，以减少交叉感染。 （二）托幼机构及小学等集体单位的预防控制措施 1.本病流行季节，教室和宿舍等场所要保持良好通风，每日对门把手、楼梯扶手、桌面等物体表面进行擦拭消毒。当地发生本病流行时，要增加每日擦拭、消毒次数。 2.每日对玩具、教具、生活用具、餐具等物品进行清洗消毒； 3.每日进行晨检，发现可疑患儿时，要对患儿采取及时送诊、居家休息的措施；对患儿所用的物品要立即进行消毒处理； 4.发现患儿时，要及时向卫生和教育部门报告。根据疫情控制需要当地教育和卫生部门可决定采取托幼机构或小学放假措施。 5．根据病情，患病儿童居家或住院隔离、治疗，建议期限为症状出现后2周且症状消失，或症状消退后一周。康复返园后要注意个人卫生。 （三）医疗机构的预防控制措施 1.疾病流行期间，医院应实行预检分诊，并专辟诊室（台）接诊手足口病人，引导发热出疹患儿到专门诊室（台）就诊，候诊及就诊等区域应增加清洁消毒频次，室内清扫时应采用湿式清洁方式； 2.医务人员在诊疗、护理每一位病人后，均应认真洗手或对双手消毒； 3.诊疗、护理病人过程中所使用的非一次性的仪器、物品等要擦拭消毒； 4.同一间病房内不应收治其他非肠道病毒感染的患儿。重症患儿应单独隔离治疗； 5. 对住院患儿使用过的病床及桌椅等设施和物品必须消毒后才能继续使用； 6.患儿的呼吸道分泌物和粪便及其污染的物品要进行消毒处理； 7.医疗机构发现手足口患者增多或肠道病毒感染相关死亡病例时，要立即向当地卫生行政部门和疾控机构报告。 8.完善诊疗纪录。各级各类医疗机构包括村卫生室要建立健全门诊日志，出入院登记要详细、认真，尤其要详细登记患者的家庭住址、家长姓名等，以利于开展流调和传染源追踪。 十、健康教育 以广播、电视、网络、报纸、宣传单等各种宣传形式，开展肠道传染病防病知识宣传，告诫家长不要带儿童到人群聚集的公共场所，不要与患病儿童接触；纠正儿童不良习惯，餐前便后要经常洗手，对儿童的玩具、餐具、衣物、用品要经常消毒，托幼机构课间洗手等，家长要注意个人卫生，养成良好的卫生习惯。 附件 1． 甘肃省手足口病应急处置流程（略） 2．　标本采集和保存技术要求一览表 3．　手足口病病例标本送检登记表 4．　手足口病个案调查表 5．手足口病临床标本检测结果报表 6．手足口病日报告统计表 7．　正确的洗手方法 8． 肠道病毒消毒方法 9． 手足口实验室检测方案 附件2 标本采集和保存技术要求一览表

病人类型

种类

采集时间和频次

采集方法

保存条件

一般病例

血清

入院后立即采集

真空采血管无菌采集全血，分离血清。最好在使用抗生素前采集。

如当天内送达实验室，可4℃-8℃冷藏保存，否则应-20℃以下低温保存，-70℃最佳，

咽拭子

入院后立即采集

塑料杆拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头分别浸入含3ml病毒或细菌采样液的螺口塑料管中

同上

便标本

1、入院后立即采集；

2、临床检查采集标本时留样

无菌管采集粪便标本，标签清楚

同上

有出疹症状病例

疱疹液

有疱疹时

无菌采集

同上

有明确脑膜脑炎或脑炎症状病例

脑脊液

急性期

无菌采集

同上

死亡病例

心脏穿刺组织

死亡后未做尸检时采集

 　

同上

肺穿刺组织

心包液

胸腔积液

尸检标本

 　 　

2份同上，1份福尔马林充分固定后，4℃保存

附件3
手足口病例标本送检登记表
编号：- （按照国家标准编码：省编码＋市编码＋县编码＋病例序号） 一、一般情况 1.1患者姓名　 ，若为14岁以下儿童，家长姓名　 1.2性别 1.3出生日期　 年 月 日（阴/阳历） 二、发病情况 2.1发病日期　年　 月日 2.2初诊日期　年　 月日 2.3初步诊断：_______________________________ 2.4临床症状：（1）轻型　（2）重型 2.5是否住院　（1）是（2）否 三、标本采集情况

标本类型

送检标本编号

采样日期

是否

冷藏

标本量

收样

日期

检测

日期

实验结果

rt-pcr

rd

hep-2

中和抗体滴度

咽拭子

 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

血

清

急性期

 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

恢复期

 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

粪便标本

 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

脑脊液

 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

疱疹液

 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
注：送检标本编号为“病例编号＋标本类型”，其中“t”为咽拭子代码， “s1”为急性期血清代码，“s2” 为恢复期血清代码，“f”为粪便标本代码，“csf”为脑脊液代码，“h”为疱疹液代码。 采样人：　 采样单位：　 送样人： 附件4
手足口病个案调查表
编号：- （按照国家标准编码：省编码＋市编码＋县编码＋病例序号） 调查单位：_______________是否报传染病卡 （1）否（2）是 卡号 一、一般情况 1．患者姓名　 2．性别 3．出生日期　 年 月 日 4．职业　 （1）托幼儿童　（2）散居儿童 　（3）学生 　（4）其他 5．工作单位（就读学校或托幼机构） 6．监护人姓名： 　　与患儿关系（父、母、祖父母、外祖父母、其他） 联系电话： 7．现住址　市　 乡（镇、街办）　村（居）　号 8 ．身高 　厘米　 体重 公斤 9 ．有无既往病史（1）无　（2）有，主要疾病 二、发病及就诊情况 1．发病日期　年　 月日 2．初诊日期　年　 月日；初诊单位　 （省级/市级/县级/乡级/村级） 初步诊断：_______________________________ 3．临床症状：（1）轻型　（2）重型 4．是否住院治疗（1）否　（2）是 ，如住院，则： 4.1所住医院____________________ 4.2入院日期　年　 月日 时 4.3入院诊断　 4.4出院日期　年　 月日 4.5出院诊断　 5．预后：（1）痊愈（2）好转（3）未愈（4）死亡，死亡日期 年　 月日时 （5）其他　 ； 后遗症　①无　②有，　 三、临床情况 （一）临床表现 1．发热　（1）无　（2）有，最高 ℃，发热持续时间　 天 2．皮疹（1）无　（2）有，如有，部位　①手　②足　③臀 ④其他：_________________ 3．口腔粘膜上有无出现溃疡/疱疹　 （1）无（2）有 4．呼吸系统症状 （1）无 （2）有，如有请选择 ①流涕　 ②咳嗽　③咽痛 ④ 其他：__________________________ 5．消化系统症状：（1）无 （2）有，如有请选择 ①恶心　 ②呕吐，如有，呕吐方式：①喷射性 　②非喷射性　③不详 ③腹痛　 ④腹泻　⑤ 其他：_______________ 6．神经系统症状：（1）无 （2）有，如有请选择 ①头痛 ②精神异常　③嗜睡 ④肌体无力 ⑤ 肢体抖动 ⑥意识障碍 ⑦昏迷　⑧惊厥 7．心律失常：（1）无　（2）有 8．颈项强直：（1）无　（2）有 9．巴氏症：（1）无　（2）有 10．克氏症：（1）无 （2）有 11．布氏症：（1）无 （2）有 12．腱反射：（1）正常 （2）亢进　（3）减弱 13．肌张力：（1）正常 （2）亢进　（3）减弱 （二）辅助检查 1．有无血常规检测：（1）无 （2）有，有则： wbc（　 ×104/l），n（　%），l（　%） 2．有无脑脊液检测：（1）无 （2）有，有则 压力（ pa），外观（正常/异常），细胞记数（　 个），蛋白（　）糖含量（） 3．有无x线检查：（1）无　（2）有，表现为　 4．心肌酶谱：（1）无　（2）有，肌钙蛋白酶　肌红蛋白酶　 四、标本采集情况

标本类型

送检标本编号

采样日期

是否

冷藏

标本量

收样

日期

检测

日期

实验结果

rt-pcr

rd

hep-2

中和抗体滴度

咽拭子

 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

血

清

急性期

 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

恢复期

 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

粪便标本

 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

脑脊液

 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

疱疹液

 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
注：送检标本编号为“病例编号＋标本类型”，其中“t”为咽拭子代码， “s1”为急性期血清代码，“s2” 为恢复期血清代码，“f”为粪便标本代码，“csf”为脑脊液代码，“h”为疱疹液代码。 调查人_______________　 调查日期： 年月　 日 附件5 甘肃省手足口病临床标本检测结果报表

编号

姓名

性别

年龄

现住址

发病

日期

临床诊断

标本

类型

采样

日期

检测

日期

实验结果

rt-pcr

rd

hep-2

中和抗体滴度

轻型

重型

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

报告单位： 　 填表人： 填报日期：联系方式： 注释：1.凡是检测的标本不论结果是否阳性均应填写本表；表中每一项内容均要填写完整； 2.编号填写：按照国家标准编码：省编码＋市编码＋县编码＋病例序号； 3.如同一病例采集2份级以上标本时，每一份标本填写一行，检测结果为阴性的标本也要 附表6　 甘肃省手足口病疫情相关信息日报表

报告单位

疫情报告①

住院情况②

居家治疗情况③

重症病例情况④

当日新增病例数

累计病例数

当日新增死亡数

累计死亡数

当日住院新增数

现住院数

累计住院数

当日治愈出院数

累计治愈出院数

当日居家治疗新增数

现居家治疗数

累计居家治疗数

当日治愈数

累计治愈数

当日新增数

现住院数

　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

合计

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

　

报告单位（公章）： 注：1.本表累计数均为2008年1月1日至报告日的合计。 2.县区汇总时报告单位为医院或卫生院；市州汇总时为县区名称。 3.①以“疾病监测信息报告管理系统”中“截至昨日24时的累计统计报表”数据填报；②、③、④以截止昨日24时现有数据填报。 报出时间：年　月　日　时　分填表人：联系电话：审核人： 附件7
正确的洗手方法
正确的洗手方法是个人良好卫生习惯重要内容之一，能有效的防止肠道病毒的传播。在与患者接触后，触摸眼、口、鼻前，打喷嚏或咳嗽后，如厕后，带口罩前及摘口罩后，接触公共设施如扶手、门柄、电梯按钮、公共电话后、从外面回家后等均应及时洗手。推荐较合理的五步洗手法：湿、搓、冲、捧、擦。 一、湿 在水龙头下把手淋湿，擦上肥皂或洗手液。 二、搓 手心、手臂、指缝相对搓揉20秒： （一）掌心相对，手指并拢相互摩擦； （二）手心对手背沿指缝相互搓擦，交换进行； （三）掌心相对，双手交叉沿指缝相互摩擦； （四）一手握另一手大拇指旋转搓擦，交换进行； （五）弯曲各手指关节，在另一手掌心旋转搓擦，交换进行； （六）搓洗手腕，交换进行。 三、冲 用清水把手冲洗干净。 四、捧 用清水将水龙头冲洗干净，再关闭水龙头。 五、擦 用干净的毛巾/纸巾擦干或烘干机烘干。 附8
肠道病毒消毒方法
一、环境消毒要点 （一）不需要大规模喷洒消毒。 （二）只需要对经常接触的物体表面（如门把手、课桌椅、餐桌、婴儿床栏杆、楼梯把手等）、玩具、游乐设施、寝具及书本等做重点性消毒。 （三）清洁完毕的物体可移至户外，接受阳光照射，通过紫外线杀灭病毒。 二、消毒方法的适用 （一）粪便：可用生石灰以1：1的比例与其搅拌均匀消毒。 （二）食、饮具：用250毫克/升有效氯含氯消毒剂溶液浸泡30分钟。 （三）生活用具、玩具、校舍、书籍：用500毫克/升含氯消毒剂溶液擦拭消毒，作用时间30分钟，或用0.3%过氧乙酸作用60分钟，或用紫外线灯直接照射30分钟。 （四）患者衣、被单：阳光下暴晒或煮沸20分钟或用500毫克／升有效氯含氯消毒剂浸泡30分钟。 （五）盛放排泻物的容器：用500毫克／升有效氯含氯消毒剂浸泡120分钟。 （六）饮用水：用1～3毫克/升有效氯含氯消毒剂如漂白粉、优氯净等作用30分钟。 （七）灭蝇：可用5%氯氰菊酯（奋斗呐）、2.5%溴氰菊酯或其他杀虫剂，按说明书使用。 （八）生活污水：用50毫克/升有效氯含氯消毒剂作用120分钟。 （九）垃圾：用1000毫克/升有效氯含氯消毒剂溶液喷雾作用120分钟。 附件9
手足口病实验室检测方案 （试行）
为规范手足口病的标本采集、运送及实验室检测操作程序，提高检测准确性，从而为手足口病的明确诊断和相关实验研究提供可靠的依据，特制定本方案。 手足口病的实验室检测原则和程序 手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行病毒分离和病毒鉴定，如果没有采到合适的临床标本，或无法进行病毒分离，也可以通过血清学检测（如中和实验）来检测血清中的中和抗体，或直接从临床标本中检测病毒的核酸来诊断（见下图：手足口病的实验室诊断流程图）。 一般是由省级病毒实验室进行病毒的分离，爆发疫情范围较大时，国家参比实验室也可以提供技术支持。病毒分离成功后，送至国家参比实验室进行鉴定或复核，同时对全国手足口病的病原进行病毒学监测。国家参比实验室接到标本后，在30日内将结果反馈给省级实验室。 很多血清型的肠道病毒能引起手足口病，不同细胞系对不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同时期肠道病毒的流行株也不同。通常用于肠道病毒分离的细胞系为rd细胞（对ca16和ev71敏感）、hep-2细胞（对某些柯萨奇b组病毒敏感）等，联合使用上述两种或更多细胞（如vero细胞）有助于分离到更多的肠道病毒。 使用血清型特异性的中和抗血清进行的中和实验是肠道病毒鉴定的基本方法，如果使用了适当的抗血清，实验结果是比较可靠的。因为肠道病毒包括若干个血清型，通常使用组合抗血清进行鉴定，有些组合抗血清已经商品化。 当无法进行病毒分离或得不到适用于病毒分离用的标本时，血清学检测可以为肠道病毒的感染提供一个间接的证据。一般用急性期血清与恢复期血清的检测结果进行比较，抗体滴度呈四倍或以上增高证明有急性感染。但是，无症状的肠道病毒感染也是常见的，所以对检测结果的解释要慎重一些。 为了提高检测速度，也为了辅助中和实验法进行毒株鉴定，最近很多实验室都使用分子生物学方法。目前，用分子生物学方法对肠道病毒进行定型还没有统一的标准，而且要根据检测目的选择使用适用的方法。 检测结果的评价 　　如果从临床标本中分离到肠道病毒，尤其是分离自脑脊液、疱疹液，那么很可能该病毒就是病因病原。当无法进行病毒分离或未分离到病毒时，血清学诊断方法可以作为病毒感染的间接证据。对于难以分离到的肠道病毒，分子生物学方法如rt-pcr是很有用的。肠道病毒有时引起无症状感染，所以实验结果的实际意义应结合临床过程和流行病学资料进行解释。 实验室诊断标准 　　根据手、足、口等部位典型皮疹即可作出hfmd临床诊断，流行病学接触史有助于诊断，临床诊断病例中符合下列之一，即为实验室诊断病例： 1.患者的粪便标本、咽拭子标本中病毒分离阳性率远高于对照人群； 2.肠道病毒型特异性中和抗体滴度≥1∶256；或恢复期血清中肠道病毒型特异性中和抗体较急性期有4倍或4倍以上增高； 3.在病变组织中如疱疹液或脑脊液中分离到病毒； 4.自患者血清、疱疹液或脑脊液等标本中检测到病原体核酸。 一、标本采集对象 标本采集对象是暴发疫情出现时手足口病的临床诊断病例和病例发病所在社区（村）的临近无病例的社区（村）或托幼机构的5岁以下的儿童（作为健康对照人群）。 用于病毒分离的标本包括粪便、咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系统症状，可以采集脑脊液标本。对于血清学诊断，需要在急性期和恢复期采集双份血清标本。临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融，如果不能确保-20℃的条件，应该在0～8℃运输和保存。标本应冷冻运输，运输时要附有必要的信息，如标本编号、发病日期和标本采集日期。 二、标本种类及采集、运送 （一）粪便标本 采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5～8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。 （二）咽拭子标本 采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。 （三）血清标本 采集急性期（发病0～3d）和恢复期（发病14～30d）双份配对血清用于抗体检测。静脉采集3～5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于－20℃以下冰箱中冷冻保存。 （四）疱疹液 在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒具有很高的诊断价值，可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。 （五）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测，从脑脊液中分离病毒也具有很高的诊断价值。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0～2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。 （六）病例密切接触者的标本采集 选择典型病例所在的托幼机构、或所在村，以新发病例密切接触者为采样对象，采集单份粪便和血清标本。 （七）健康对照的标本采集 选择患儿发病所在社区（村）的临近无病例的社区（村）或托幼机构。采集5岁以下的儿童单份粪便和血清标本。 三、标本采集注意事项 在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中分离病毒具有很高的诊断价值，但对于不同血清型的肠道病毒，脑脊液中的病毒分离率是大不相同的。用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中，如维持液或生理盐水，以防干燥。用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。不能立即检测的标本应冷冻保存。对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。 四、实验室检测操作流程 （一）病毒分离 1.试剂配置 （1）细胞的生长液、维持液的配制见下表
　

生长液（gm）

维持液（mm）

eagle`s液（mem）

86.5ml

92.5ml

l-谷氨酰胺200mm

1.0ml

1.0ml

胎牛血清

10.0ml

2.0ml

7.5%nahco3溶液

2.5ml

3.5ml

p.s溶液*（青霉素及链霉素）

1.0ml

1.0ml

（2）粪便标本的处理液 完全pbs液中加入p．s溶液，终浓度为青霉素500单位/ml，链霉素为500μg/ ml。 2．病毒分离细胞系 许多细胞系可支持人肠道病毒（如ev71、ca16）生长。 对于检测手足口病的病原来说，建议所有怀疑含ev71、ca16的标本均需接种到以下两种细胞系： ?rd细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。 ?hep-2细胞，来源于人喉癌上皮细胞。 3．标本的处理 （1）粪便标本的处理 操作步骤： 1.1在离心管上标记标本号； 1.2每管中加入10ml pbs、1g玻璃珠、1ml氯仿； 1.3在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）； 1.4剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于－20℃； 1.5确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20min； 1.6在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在1500g条件下离心20min； 1.7在生物安全柜中将每一份标本的上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理一次）； 1.8一管粪便悬液冻存于－20℃作为备份，另一管存于4～8℃以备接种。 （2）疱疹液标本的处理 疱疹液标本通常直接用于病毒分离。 （3）脑脊液标本的处理 脑脊液标本通常直接用于病毒分离。 （4）咽拭子标本的处理 咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，然后在4℃条件下，10000 rpm离心20min，用上清接种到细胞上，如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。 4．接种和观察（病毒分离） （1）显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康的。一个健康的单层细胞会在传代后3d左右形成； （2）倒掉生长液（gm），换上1～1.2ml的维持液（mm）； （3）每一份标本需要同时接种2支rd细胞和2支hep-2细胞，正确标记每支细胞培养管（包括标本的编号、日期、传代数）； （4）每一种细胞至少标记一管作为阴性对照； （5）每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度要求36℃（对于ahc标本的病毒分离，尤其是ev70的分离培养，强烈建议降低培养温度，一般可为34～35℃）； （6）使用倒置显微镜每天观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应（cpe）的出现（如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等）； （7）记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录cpe（1＋～4＋）、提示细胞受毒性反应、老化或污染的影响而发生的变化（1＋，<25%； 2＋， 25%～50%； 3＋， 50%～75%； 4＋， 75%～100%）； （8）如果有特征性的肠道病毒cpe出现，要如实记录，并观察直到75%的细胞发生变化（3＋ cpe），然后储藏在－20℃以备二次传代。同一病例的二次传代的病毒分离物可以放到一起用于进一步的鉴定； （9）第1代培养见可疑细胞病变时继续传代，待细胞病变稳定出现后－20℃或－70℃冻存； （10）一代阳性分离物再传二代，如果又有明显的cpe出现，将病毒保存在－20℃冰箱（二代病毒）。因二代病毒滴度高于用一代病毒，所以选用二代病毒进行鉴定。 （11）如果7d之后没有cpe出现，那么盲传1代继续观察7d。（注意：同一病例标本的细胞培养物不能混在一起再传代，例如：不同细胞的培养物应单独传代）； （12）盲传2代后，仍然没有出现cpe的，则判定为阴性； （13）注意：如果接种后24h内出现cpe，很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。取100μl阳性分离物传二代，继续观察；或者在接种标本吸咐1h后用维持液清洗细胞层，可能会降低毒性反应。 （14）几个概念： a：毒性反应：如果在接种后1～2d内细胞快速地调亡，这可能是由于标本中含有毒性物质而导致的非特异性毒性反应。这些已接种标本的试管应在－20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型细胞中（此时是第二代）。如果又出现了毒性反应，那么应该取原始标本用pbs稀释10倍，再次接种到同种细胞中。这时应被认为是第一代。 b：微生物污染：由于细菌污染而造成培养液混浊或细胞死亡经常使病毒造成的cpe无法确定或根本无法出现。重新取原始标本，用氯仿处理，按上述步骤重新接种到新鲜细胞上。 c：盲传：有时一周之后传代细胞会老化，甚至细胞对照也出现了病变。这时已接种标本的试管应在－20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型的新鲜单层细胞中，再观察7～10d。如果盲传两代后仍然没有产生cpe，那么认为这个标本是阴性的。 5．病毒分离结果解释： rd细胞支持hfmd的主要病原体--ca16和ev71的复制，ca16和ev71均能在rd细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（cpe），表现为细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加，最后细胞自管壁脱落。但相同滴度的ca16和ev71在rd细胞中生长的速度不同，ev71的生长速度要快于ca16，表现为ev71感染rd细胞后出现cpe的时间比ca16早，ev71接种细胞后出现cpe很快，但ca16一般要经过2次以上传代才出现明显的cpe。 若在使用rd细胞分离的同时再增加hep-2细胞，可提高肠道病毒的分离率（分离出其它可能致hfmd的病原体，如一些柯萨奇b组病毒）。但ca16和ev71在hep-2细胞中均不繁殖。 从hfmd患儿的脑脊液、血液、疱疹液等临床标本中分离出病毒有诊断价值，但单从咽拭子或粪便中分离到病毒不能确诊。从有上述临床症状群患者的咽拭子或粪便中重复分离到同一型病毒，且从周围患同样疾病者中也检出相同的病毒，且病毒分离率远高于正常人群，则有诊断的参考价值。 （二）测定人双份血清标本的中和抗体滴度 比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度，可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法，最常用的是中和实验，即用微量板法测定抗体滴度，是目前人肠道病毒抗体检测的最常用方法，该方法精确且具有型特异性。 作为肠道病毒感染的诊断方法之一，可以测定血清（或脑脊液）中肠道病毒中和抗体的滴度，通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较，抗体滴度4倍或4倍以上增高证明病毒感染。但是，不明显的肠道病毒感染（隐性感染）也很常见，所以在评估检测结果时就要小心一些。在中和实验中，一般要用人肠道病毒参考毒株（即原型株，ev71原型株为brcr株，ca16原型株为g-10株），有时同时（或单独）使用临床分离株会有助于得到更准确的检测结果。 使用对肠道病毒敏感的细胞，如rd细胞。用病毒（血清）稀释液（下面液体配制中的c液，可用维持液代替）稀释血清和制备病毒悬液，因为是用病毒来确定血清（csf）中抗体的滴度，所以要使用参考病毒（原型株），但有时使用所分离到的毒株（临床分离株）有助于得到更准确的检测结果，当然，分离株的滴度（100 ccid50/0.05ml）要事先测定。 中和实验的检测原理：病毒感染敏感靶细胞后，引起细胞形态学变化，出现致细胞病变效应（cpe），特异性中和抗体与病毒结合后，可使病毒颗粒失去感染性，抑制cpe的出现。 1．液体配制 a液：血清处理液：（100ml中含下列液体） mem85ml 3% l-谷氨酰胺　 1ml 7.5%碳酸氢钠2ml 胎牛血清 2ml 青、链霉素（各10000u/ml）10ml b液：细胞营养液：（按生长液配方配制，100ml中含下列液体） mem85ml 3% l-谷氨酰胺　 1ml 7.5%碳酸氢钠2ml hepes　 1ml 胎牛血清 10ml 青、链霉素（各10000u/ml）1ml c液：病毒（血清）稀释液：（按维持液配方配制，100ml中含下列液体） mem93ml 3% l-谷氨酰胺　 1ml 7.5%碳酸氢钠2ml hepes　 1ml 胎牛血清 2ml 青、链霉素（各10000u/ml）1ml 2．攻击病毒ccid50滴定和滴度梯度制备 （1）将增殖后的病毒悬液冻融3次，然后在4℃、12000rpm条件下离心10min，取上清液分装于2支冻存管中，每管1.5ml，一般每管应在一次试验中用完，有剩余者应废弃； （2）加eagle液10倍系列稀释为10-1至10-8病毒液，各加入细胞板内，每孔50μl，每稀释度4孔细胞； （3）每孔加细胞悬液50μl，同时设细胞对照（50μl稀释液＋50μl细胞悬液）， 36℃培养7d，观察细胞病变； （4）按behrens-k?rber公式计算出分离病毒株的ccid50； log ccid50 = l-d （s -0.5 ），其中： l = 实验中使用的最低稀释度的log值； d = 稀释梯度的log值； s = 终判时阳性部分的总和（即出现cpe的细胞孔所占的比例之和）。 （5）正式试验前应先滴定攻击病毒2～3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100 ccid50的病毒载量； （6）按照计算好的稀释比例配制攻击病毒，求出试验所需的病毒总量（即100 ccid50/0.05ml）； （7）取3支小试管，每只加病毒稀释液（液体配制中的c液）0.9ml； （8）用带滤芯的吸尖（art吸尖）吸0.1ml已经稀释好的攻击病毒液（即10 ccid50/0.05ml）到第一支小试管中，换另一支art吸尖，轻轻并彻底地混匀，避免产生大量气溶胶，按照此方法依次稀释至1 ccid50/0.05ml和0.1 ccid50/0.05ml。 3．稀释血清 （1）发病1～3d内采取患者急性期血清，发病后2～4周采取恢复期血清，分别－20℃冻存备检。 （2）取无菌小试管若干支（每份血清使用一支）置试管架上，每管加血清处理液（上面液体配制中的a液）0.3ml，加待测血清0.1ml，盖紧塞子，震摇混匀，放4℃冰箱过夜，即为1：4稀释血清。次日56℃、30min灭活。 （3）打开独立无菌包装48孔组织培养板，纵向使用，每孔加血清稀释液（上面液体配制中的c液）0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器取处理过的血清0.1ml加入第一孔（即为1：16），吹吸8～10次，吸0.1ml加入第二孔（即为1：64），依次至1：1024，血清稀释的过程中不必换吸尖。即每份血清标本进行4倍倍比稀释，即1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024。 （4）每份血清标本的每个稀释度都要平行做两孔。 4．病毒中和抗体测定的操作步骤： （1）取一块96孔板横向使用，每块板可以做8份（4对）待测血清，版面设计如下图所示。a1-a2孔（b1-b2、c1-c2、d1-d2、e1-e2、f1-f2、g1-g2、h1-h2）中每孔加入1：1024稀释度的待测血清0.05ml，不必换吸尖，在a3-a4孔（b3-b4、c3-c4、d3-d4、e3-e4、f3-f4、g3-g4、h3-h4）中每孔加入1：256稀释度的待测血清0.05ml，a5-a6孔（b5-b6、c5-c6、d5-d6、e5-e6、f5-f6、g5-g6、h5-h6）中每孔加入1：64稀释度的待测血清0.05ml，a7-a8孔（b7-b8、c7-c8、d7-d8、e7-e8、f7-f8、g17-g8、h7-h8）中每孔加入1：16稀释度的待测血清0.05ml，a9-a10孔（b9-b10、c9-c10、d9-d10、e9-e10、f9-f10、g9-g10、h9-h10）中每孔加入1：4稀释度的待测血清0.05ml，a11-a12孔（b11-b12、c11-c12、d11-d12、e11-e12、f11-f12、g11-g12、h11-h12）为每份待测血清对照孔，每孔中补加稀释液0.05ml； （2）上述孔中分别加入病毒0.05ml（病毒滴度事先已经稀释为100 ccid50/0.05ml）； （3）盖好盖子后用微量板混匀器混匀，放入36℃ co2孵箱中孵育2h； （4）另取一块96孔板纵向使用，做100 ccid50/0.05ml病毒滴度的核实（每次实验都必须做）。每孔先加病毒稀释液（试剂配制中的c液）0.05ml，然后从0.1 ccid50/0.05ml加起，每孔0.05ml，每个稀释度8孔，不必更换吸尖，一直加至100 ccid50/0.05ml；同时留出4孔做为细胞对照孔，每孔加入0.1ml病毒稀释液，然后放入4℃冰箱中暂存； （5）在孵育期间，用消化液消化细胞，准备细胞悬液，细胞悬液的浓度为2×105个/ml，每块96孔板至少需要准备10ml； （6）孵育结束后每个待测血清孔、血清对照孔（待检标本板）和病毒回滴孔和细胞对照孔（病毒回滴板）分别加入0.1ml细胞悬液，然后用微量板混匀器混匀，放入36℃ co2孵箱中孵育培养； （7）使用倒置显微镜每天观察cpe，并记录病毒滴定结果，以不产生细胞病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价。当100 ccid50/0.05ml的病毒对照孔出现完全病变时，判定最终结果（约5～7d）； （8）注意：如果病毒对照结果（病毒回滴）不在32～320 ccid50/0.05ml的范围内，实验无效，就要重复实验。 5．结果判定： 当最高稀释度血清的2孔中有1孔出现细胞病变，另一孔不出现细胞病变，该稀释度的倒数计即为该血清标本的中和抗体效价；当高稀释度2孔完全病变，相邻低稀释度2孔完全不病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当两个相邻稀释度血清均出现1孔细胞病变，另1孔不出现细胞病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价。 对于hfmd的双份血清中和实验结果来说，如果恢复期血清较急性期血清ev71或ca16中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高即可确诊；如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高可证实该肠道病毒感染，是否为病因需要其它相关实验证实；如果单份血清中和抗体滴度大于1：256也有诊断意义，血清中和抗体滴度为1：128判定为可疑阳性。 （三）逆转录-聚合酶链反应（rt-pcr） 1．rna提取 可使用商业化试剂盒来提取rna，如使用qiagen viral rna mini extraction kit（cat：52904）从临床标本或病毒分离培养物中提取病毒rna； （1）向一支1.5ml离心管中加入560μl的avl缓冲液（含carrier rna）； （2）再向这支离心管中加入140μl临床标本或病毒分离培养物，充分混匀至少15s； （3）室温下（15℃～25℃）放置10min，然后瞬时离心； （4）加入560μl纯酒精，充分混匀至少15s，瞬时离心； （5）小心加入约630μl的混合溶液至qiaamp柱中（试剂盒附带），将qiaamp柱套在收集管上，然后8000 rpm离心5s，使液体通过滤膜； （6）弃去收集管中的液体，重复第6步骤； （7）弃去收集管中的液体，小心加入750μl的aw1缓冲液，8000 rpm离心5s，使液体通过滤膜； （8）弃去收集管中的液体，小心加入750μl的aw2缓冲液，8000 rpm离心5s，使液体通过滤膜； （9）弃去收集管中的液体，13000 rpm再次离心1min； （10）将qiaamp柱放入一支干净的1.5ml的离心管中； （11）向膜上加入40μl的eb缓冲液，然后室温下静置2～5min； （12）在离心机中以8000 rpm的速度离心1min，离心下来的液体即为所需的核酸溶液。 2．rt-pcr扩增 （1）引物序列合成 1）人肠道病毒（包括ev71、ca16）核酸检测通用引物序列： pe2（上游）：5`- tcc ggc ccc tga atg cgg cta atc c -3` pe1（下游）：5`- aca cgg aca ccc aaa gta gtc ggt cc -3` 2）ev71核酸检测引物序列： ev71-s（上游）：5`- gca gcc caa aag aac ttc ac -3` ev71-a（下游）：5`- att tca gca gct tgg agt gc -3` 3）ca16核酸检测引物序列： cox a16-s（上游）：5`-att ggt gct ccc act aca gc-3` cox 　a16-a（下游）；5`-tca gtg ttg gca gct gta gg-3` （2）实验设计 1）在pcr记录纸（实验记录纸）上记录本次实验操作者姓名，实验日期，所鉴定标本的名称以及标本的顺序，与pcr仪排列的顺序一致。 2）标记好加标本和对照的pcr管（阳性对照，阴性对照和试剂对照）。 a：阳性对照：无感染性的对照rna。 b：细胞对照：使用未接种病毒的细胞悬液，最好使用与扩增病毒所用的细胞类型与代数相同的细胞。每一次实验设2个细胞对照。 c：试剂对照：用去离子水代替标本。 （3）rt-pcr扩增 1）在冰面上融化病毒标本和各种pcr试剂； 2）配下列试剂主溶液： 10×pcr buffer···································································5.0μl dntps（2.5mm each）·······················································2.0μl 上游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μl 下游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μl rna酶抑制剂（rnasin，40u/μl）······································0.5μl taq dna聚合酶（5u/μl）·················································0.5μl amv逆转录酶（10u/μl）··················································1.0μl 模板rna··········································································3.0μl rnase free dh2o···························································36.0μl 50.0μl 3）在pcr仪上进行rt-pcr反应，反应步骤如下： 42℃························45min 95℃························3min 95℃························20s 45℃························25s×32个循环 72℃························30s 72℃························10min 4℃························soak 3．电泳分析 1）将已经聚合的3%的琼脂糖凝胶放在电泳装置上； 2）在帕拉膜（parafilm）上加上6 × 电泳载样缓冲液（每个反应需1μl）。再加上5μl的pcr反应产物与之混合； 3）将电泳缓冲液倒在电泳装置中，用吸尖将样品与载样缓冲液的混合溶液加到孔中； 4）盖上盖子，接通电源，以10v/cm电压（恒定电压）电泳，大约35～40min，直到溴酚蓝跑到凝胶的底部的时候，停止电泳； 5）将胶取出，并注意保持凝胶的方向； 6）在1μg/ml的溴化乙锭溶液中染色15min，--注意：溴化乙锭溶液是有毒、致畸、并且致肿瘤的物质，操作时要加小心，并戴双层手套。如果储存在避光的容器中，溴化乙锭溶液可以重复使用； 7）在蒸馏水中涮一下凝胶； 8）在紫外透射仪下观察pcr产物电泳结果，并照相作记录。 4．结果解释 通过比较标本的pcr产物与阳性对照的pcr产物在凝胶上的位置以及大小来解释结果。 rt-pcr实验结果解释表

待检标本rt-pcr结果

鉴定结果

所有引物（－）

非肠道病毒（nev）

ev（＋），ev71（－），ca16（－）

非ev71、ca16的其它肠道病毒

ev（＋），ev71（＋），ca16（－）

ev71

ev（＋），ev71（－），ca16（＋）

ca16

五、生物安全 根据2006年1月11日卫生部制订的《人间传染的病原微生物名录》，柯萨奇病毒、埃可病毒、肠道病毒 71型和目前分类未定的其它肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物。因此在保证安全的前提下，对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全ii级或以上防护级别的实验室进行，涉及病毒分离培养的操作，应加强个体防护和环境保护。 操作粪便、脑脊液和血液等临床标本时要特别注意生物安全，要在ii级生物安全柜中进行标本处理、病毒分离和病毒鉴定，无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫。 灭活后的血清抗体检测与pcr检测可在生物安全i级实验室进行。 所有操作应遵守国家相关法律法规。 附件一
省级手足口病防治专家组成员名单
组　长： 孟　蕾　省疾病预防控制中心　主任医师　 13919004245 副组长： 金　颖　省卫生厅卫生监督所　副 所 长　 13893136639 雷晓燕　省人民医院（儿科）　主任医师　 3912733 陈　红　兰大一院 （传染科） 主任医师　 13109324136 组　员 沈玉鹏　 省中医院儿　科　主任医师　 13993187407 石宗珂　 省中医院儿　科　主任医师　 13893437441 苏怡凡　 甘肃省人民医院　儿　科　主任医师　 13919775197 林丽星　 兰州大学第一医院儿　科　主任医师　 13038735596 董湘玉　 兰州大学第二医院儿　科　主任医师　 13609370003 刘　华　 甘肃省人民医院　呼吸科　主任医师　 13099189673 石永生　 省妇幼保健医院　儿内科　主任医师　 13993194137 牛晨霞　 兰州市肺科医院　呼吸科　主任医师　 13919168609 王建云　 兰州市肺科医院　传染科　主治医师　 13919344388 于德山　 省疾病预防控制中心　应急办　主任技师　 13893629857 刘建地　 省疾病预防控制中心　急传科　副主任医师 13919293301 附件二
省级手足口病应急队伍 （医疗救治组、监督组、疫情处理组）
医疗救治组成员名单
组　长： 雷晓燕 省人民医院　儿　科　 主任医师　 3912733 副组长： 陈　红 兰大一院传染科　 主任医师　 13109324136 组　员 沈玉鹏　 省中医院　儿　科　 主任医师　 13993187407 石宗珂　 省中医院　儿　科　 主任医师　 13893437441 原　睿　 省中医院　儿　科　 副主任医师 13893261330 苏怡凡　 甘肃省人民医院儿　科　 主任医师　 13919775197 熊海金　 甘肃省人民医院儿　科　 主任医师　 13919780510 林丽星　 兰州大学第一医院　儿　科　 主任医师　 13038735596 董湘玉　 兰州大学第二医院　儿　科　 主任医师　 13609370003 韩玉秀　 省妇幼保健院　儿　科　 主任医师　 2321270 袁　宏　兰州大学第一医院　 传染科　副主任医师　13119307641 李宇宁　兰州大学第一医院　 儿　科　 主任医师　 13993127126 朱保权　兰州大学第二医院　 儿　科　 主任医师　 13893660155 刘　华　省人民医院 呼吸科　 主任医师　 13099189673 石永生　省妇幼保健医院 儿内科　 主任医师　 13993194137 牛晨霞　兰州市肺科医院 呼吸科　 主任医师　 13919168609 王建云　兰州市肺科医院 传染科　 主治医师　 13919344388
监督组成员名单
组　长： 金　颖　 省卫生厅卫生监督所　副所长13893136639 副组长： 张福荣　 省卫生厅卫生监督所　科　长13359426259 组　员： 李　玲　 省卫生厅卫生监督所　科　长13893222833 陈　荣　 省卫生厅卫生监督所 主任科员3236390 史　剑　省卫生厅卫生监督所 副主任科员　13609372124 冉玉昭　 省卫生厅卫生监督所　科　员13919170303 尚　晶　 省卫生厅卫生监督所　科　员13919137742 牛清煜　 省卫生厅卫生监督所　科　员13893610505
疫情处理组成员名单
组　长： 孟　蕾　省疾病预防控制中心　主任医师　 13919004245 副组长： 李　慧　省疾病预防控制中心　主任医师　 13893409208 组　员： 于德山　省疾病预防控制中心　主任技师　 13893629857 刘建地　省疾病预防控制中心 副主任医师　13919293301 刘建锋　省疾病预防控制中心 副主任技师　13893381288 蓝　弘　省疾病预防控制中心 副主任医师　13321283823 许亚宁　省疾病预防控制中心 副主任技师　13008701722 杨建军　省疾病预防控制中心　医　师 13893150465 王玉明　省疾病预防控制中心　主管医师　 13679403799

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